Pendahuluan

Metode ultrasentrifugasi, proses pemisahan molekul-molekul protein berdasarkan berat dan densitas yang berbeda menggunakan insturmen yang bekerja untuk memutar secara rotasi larutan campuran protein dalam suatu wadah dengan kecepatan tinggi agar gaya sentrifugasi bekerja pada larutan sehingga komponen protein dengan terfraksinasi, sehingga protein-protein yang diinginkan terpisah dengan komponen lainnya.

Gaya sentrifugasi yang bekerja pada partikel-partikel akan tergantung pada densitas atau massa dari partikel-partikel tersebut. partikel yang memiliki massa yang lebih besar akan mempunyai gaya sentrifugasi lebih besar dibandingkan dengan gaya sentrifugasi yang bekerja pada partikel dengan massa yang lebih kecil, sehingga partikel yang lebih besar akan mengimbangi gaya hambat dari larutan (drag force) yang menyebabkan partikel-partikel dengan massa yang lebih besar akan berada pada dasar wadah setelah proses sentrifugasi dilakukan. Sedangkan partikel dengan massa yang relatif lebih kecil akan berada pada bagian atasnya (Voelkl, 2016).

Konsep dasar metode ultrasentifugasi

Untuk mempersiapkan proses sentrifugasi terdapat dua tahap yang dilakukan, yaitu sentrifugasi diferensial dan densitas gradien sentrifugasi.

  • Sentrifugasi diferensial

Pada dasarnya memisahkan partikel-partikel berdasarkan bentuk dan ukurannya. Partikel-partikel berbedapada awalnya bercampur dalam larutan buffer untuk menjaga protein pada pH optimalnya agar tidak terjadi denaturasi. Campuran kemudian dipisahkan menjadi dua fraksi yaitu; pellet, bagian yang mengandung sedimentasi partikel dan supernatan yang terdiri dari partikel tidak tersedimentasi dalam larutan buffer.

Sentrifugasi diferensial
Sentifugasi diferensial

Seperti yang diilustrasikan pada gambar, komponen-komponen partikel akan terdistribusi secara berbeda menjadi pellet dan supernatan selama proses sentrifugasi, berdasarkan pada ukuran. Partikel yang mempunyai ukuran yang lebih besar akan cenderung untuk diendapkan pada bagian dasar (partikel berwarna putih).

Sedangkan untuk partikel dengan ukuran yang lebih kecil cenderung akan berada pada supernatan (partikel titik hitam). Untuk pemisahan yang lebih baik, supernatant yang terbentuk dapat dipisahkan dan dilakukan sentrifugasi lagi dengan laju perputaran sentrifugasi yang lebih tinggi.

  • Sentrifugasi dengan gradien densitas

mendapatkan protein yang benar-benar murni, dibutuhkan langkah untuk menghilangkan partikel kontaminan tersebut, yaitu dengan teknik yang dinamakan sentrifugasi gradient densitas.

Pada dasarnya densitas medium yang digunakan dapat ditingkatkan secara kontinyu atau diskontinyu (diskrit). Tujuannya agar pada masing-masing densitas medium yang berbeda dapat diendapkan partikel-partikel tertentu dengan densitas yang telah disesuaikan dengan densitas medium dalam tabung tersebut

Medium dengan gradien densitas kontinyu dan diskontinyu
  • Rate zonal sentrifugasi pada protein memisahkan partikel pada medium yang mempunyai gradien densitas kontinyu dengan mengandalkan laju pengendapan partikel-partikel yang hendak dipisahkan.
  • Laju pendengapan partikel-partikel tersebut dapat diketahui dari koefisien pengendapan partikel-partikel tersebut.
  • partikel-partikel dengan laju pengendapan yang sama akan berada pada zona yang sama pada medium tersebut.